杂交手段筛选阳性重组体需要（ ）。

　　杂交手段筛选阳性重组体需要（ ）。
临床执业医师考试要点解析：
☆☆☆☆考点6：基因工程基本原理；
一个完整的基因工程基本过程包括：目的基因的获取，基因载体的选择与构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组的受体细胞(子)及目的基因的表达。
1．目的基因的获取
所谓目的基因就是欲分离的感兴趣的基因，或欲表达的有意义的编码基因。
获取目的基因有如下几种途径：
（1）化学合成法
如果已知某种基因的核苷酸序列，或根据某种基因产物的氨基酸序列推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，再利用DNA合成仪通过化合成目的基因；
（2）基因组DNA
分离组织或细胞染色体DNA，利用性核酸内切酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当克隆载体拼接成重组DNA，继而转入受体菌扩增，使每个细胞内都携带一种重组DNA的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA内可能存在有不同的染色体DNA片段。这样生长的全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就代表了整个基因组，这就是所谓的基因文库。基因文库涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因文库后，结合适当筛选方法从众多的子菌株中选出含有某一基因的菌株，再行扩增，将重组DNA分离、回收，以获得目的基因的克隆；
（3）cDNA
以mRNA为模板，利用反酶合成与mRNA互补的DNA(cDNA)，再复制成双链cDNA片段。cDNA片段与适当载体连接后转入受体菌，扩增为cDNA文库。与基因文库类似，由总mRNA制作的cDNA文库包含了细胞全部mRNA信息，自然也含有我们感兴趣所编码cDNA。从cDNA文库筛选出的cDNA克隆就是分离某种蛋白质编码序列。
2．克隆载体的选择和改建
外源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将外源DNA连到复制子上，外源DNAjnu可作为复制子的一部分在受体细胞中复制。这种复制子就是克隆载体。基因工程技术中克隆载体的选择和改建是一项极富技术性的专门工作。
3．基因与载体的连接
将目的基因与载体DNA通过连接酶共价连接在一起，即DNA的体外重组。
4．重组DNA导入受体菌
受体菌多为大肠杆菌K-l2衍生的安全宿主菌。这种安全宿主菌经特殊方法处理，使之成感受态细胞，即具备接受外源DNA的能力。根据重组DNA时所采用的载体性状不同，导入重组DNA有、转染和感染等不同手段。
5．重组体的筛选
重组体DNA导入受体细胞后，经适当的培养板培养得到大量子菌落或转染噬菌斑。因为每一重组体只携带某一外源基因，而或转染时每一受体细胞(菌)又只能接受一个重组体，所以应设法鉴定哪一菌落或噬菌斑所含重组DNA确实带有目的基因。这一过程即为筛选或选择。筛选有直接筛选法(如抗药标志选择、标志补救、杂交法等)和免疫学方法(如免疫化及酶免检测分析等)。
6．克隆基因的表达
又称蛋白质表达。大肠杆菌是最常用的原核表达体系：酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞是多用的真核表达体系。由于缺乏后加工机制，大肠杆菌只能表达克隆的cDNA，而不宜表达真核基因组DNA；由于缺乏适当的翻译后加工机制，大肠杆菌表达真核蛋白质不能形成适当的折叠或糖基化修饰；表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，欲使其具有活性尚需经复性等处理。相反，真核表达体系、尤其是哺乳类动物细胞(如COS细胞和CHO细胞)是当前较理想的蛋白质表达体系。克隆化的转基因动物也可用于蛋白质表达。