线粒体外形、大小、数量和分布，用暗视野或相差显微镜可在活细胞中观察到线粒体，并可用染料詹纳斯绿鉴定。线粒体外形和大小常随细胞类型及生理条件的不同而有较大差别，在光学显微镜下呈很小的球、杆、或细丝状，以杆状的居多。在电子显微镜下，除常见的杆形、圆形外，有时还可看到环形、哑铃形或其他形状。线粒体直径在0.5～5微米范围内，长度为2～3微米，最长可达10微米。大鼠的肝细胞平均约有1000个线粒体。最少的如一种单鞭金藻，每个细胞只含有一个线粒体。动物细胞的线粒体含量一般比植物细胞多些。
线粒体在细胞内的分布，一般在需要能量较多的部位比较密集。例如，有些肌细胞（如膈肌）中线粒体呈环形或条带形分布，集结于肌原纤维“Ⅰ”带周围；在精子中线粒体围绕于鞭毛的基部。
可大致分三部分：①外膜和内膜线粒体具有内外两层膜，平均厚度都为50～60埃，内膜向腔内突起形成嵴；②内外膜之间的空间，称为膜间腔；③嵴与嵴之间的介质称为基质。各种细胞的线粒体内部结构既有共同性，又有特异性和变异性。嵴一般呈片状，在原生动物和一些植物中呈管状，也有的嵴分支形成网状。嵴的数目也有很大差别。一般需要能量较多的细胞不仅线粒体数目较多，而且每个线粒体所含嵴的密度也较大；反之则两者的数量都较少。
利用负染方法，在电子显微镜下可观察到在嵴的内膜间腔的一面排列着许多直径 8～9纳米的圆球形颗粒，并有短柄与膜连接，称为ATP酶复合体或ATP合酶(H+-ATP酶)。
线粒体主要由蛋白质和脂质组成。此外还含有两种核酸(DNA，RNA)，无机盐和辅助因子，辅酶Ⅰ(NAD)，辅酶A，腺二磷(ADP)等。整个线粒体的脂质和蛋白质比例约为200～300 毫克脂质／1克蛋白质。脂质中约有90％以上是磷脂。外膜与内膜在化学组成上有很大不同：前者脂质和蛋白质比例(1:1)比后者(0.3:1)高得多。外膜所含的磷脂主要是卵磷脂，其次是磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇较少。 胆固醇的含量约为30毫克／1克蛋白质。内膜含心磷脂很多，酸性磷脂也不少。
线粒体所含的蛋白质中有很多是酶，例如，外膜的：单胺氧化酶，犬尿氨酸羟化酶，NADH细胞色素B5还原酶，脂肪酰基CoA合成酶等;膜间腔内的:核苷二磷酸激酶，腺苷酸激酶等；内膜的：组成呼吸链的酶类，H+-ATP合酶，β-羟丁酸脱氢酶，肉碱脂酰基转移酶，NAD-NADP转氢酶等；基质内的：柠檬酸合成酶，异柠檬酸脱氢酶，延胡索酸酶，苹果酸脱氢酶，乌头酸酶，谷氨酸脱氢酶以及脂肪酸氧化酶系等。