化学消毒剂对细菌的作用机制，不同的化学消毒剂其作用原理也不完全相同，大致归纳为三个面。一种化学消毒剂对细菌的影响常以其中一方面为主，兼有其他方面的作用。
（1）改变细胞膜通透性 表面活性剂（Surface-active agent）、酚类及醇类可导致胞浆膜结构紊乱并干扰其正常功能。使小分子代谢物质溢出胞外，影响细胞传递活性和能量代谢。甚至引起细胞破裂。
（2）蛋白变性或凝固酸、碱和醇类等有机溶剂可改变蛋白构型而拢乱多肽链的折叠方式，造成蛋白变性。如乙醇、大多数重金属盐、氧化剂、醛类、染料和酸碱等。
（3）改变蛋白与核酸功能基团的因子作用于细菌胞内酶的功能基（如SH基）而改变或抑制其活性。如某些氧化剂和重金属盐类能与细菌的-SH基结合并使之失去活性。